植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)組成及操作步驟

　　實(shí)驗(yàn)原理

　　本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)水平。 用純化的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包 被單抗的微孔中依次加入植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)，再與 HRP 標(biāo)記的 1,5- 二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗 滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終 的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)呈正相關(guān)。用酶 標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中植物 1,5-二磷酸核酮 糖羧化酶(RubisCO)濃度。

　　試劑盒組成:

　　1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶

　　7 終止液 6ml×1 瓶 2 酶標(biāo)試劑 6ml×1 瓶

　　8 標(biāo)準(zhǔn)品(300ng/L) 0.5ml×1 瓶 3 酶標(biāo)包被板 12 孔×8 條

　　9 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1 瓶 4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶

　　10 說(shuō)明書(shū) 1 份 5 顯色劑 A 液 6ml×1 瓶

　　11 封板膜 2 張 6 顯色劑 B 液 6ml×1/瓶

　　12 密封袋 1 個(gè)

　　植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)組成及操作步驟 標(biāo)本要求

　　1.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能 馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

　　2.不能檢測(cè)含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的(HRP)活性。

　　操作步驟

　　1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)罕驹噭┖刑峁┰稑?biāo)準(zhǔn)品一支，用戶(hù)可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀 釋。

　　150ng/L

　　5 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

　　150μl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

　　75ng/L

　　4 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

　　150μl 的 5 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

　　37.5ng/L

　　3 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

　　150μl 的 4 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

　　18.75 ng/L

　　2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

　　150μl 的 3 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

　　9.375 ng/L

　　1 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

　　150μl 的 2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2. 加樣：分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、 待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl， 然后再加待測(cè)樣品 10μl(樣品最終稀釋度為 5 倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡 量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

　　3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

　　4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用

　　5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復(fù) 5 次，拍干。

　　6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。

　　7. 溫育：操作同 3。

　　8. 洗滌：操作同 5。

　　9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

　　10 分鐘.

　　10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

　　11. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD 值)。 測(cè)定應(yīng)在加終止 液后 15 分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。